Un nuevo microscopio revolucionario podría revelar los secretos de la maquinaria celular

Investigadores de la Universidad de California - Berkeley han desarrollado un microscopio revolucionario que utiliza un láser extremadamente potente para hacer visibles estructuras celulares que antes eran invisibles. Esta innovadora tecnología mejora drásticamente la claridad de imagen, permitiendo a los científicos examinar pequeñas proteínas que los microscopios electrónicos convencionales no pueden capturar con facilidad. Se espera que esta herramienta ofrezca una mirada sin precedentes a cómo interactúan las diminutas máquinas moleculares dentro de las células, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la vida.

El dispositivo, denominado "placa de fase láser", podría mejorar significativamente la microscopía electrónica criogénica (cryo-EM), una técnica que ha revolucionado el estudio de las estructuras proteicas y acelerado el descubrimiento de medicamentos en la última década. Sin embargo, uno de sus mayores desafíos ha sido la dificultad para obtener imágenes claras de la mayoría de las proteínas humanas, que son tan pequeñas que se escapan a la capacidad de resolución de los microscopios actuales.

La nueva tecnología láser podría permitir a los científicos capturar imágenes de proteínas que son hasta un tercio más pequeñas que las que actualmente presentan problemas de visibilidad. Además, se prevé que tenga un impacto aún mayor en la tomografía electrónica criogénica (cryo-ET), que combina imágenes tomadas desde múltiples ángulos para construir vistas tridimensionales de proteínas y otras moléculas. Esta técnica puede revelar cómo las proteínas se organizan e interactúan en su entorno celular natural, a diferencia de otros métodos que estudian moléculas aisladas en solución.

El profesor de física Holger Müller, quien lideró el desarrollo del microscopio, explicó: "Cryo-EM se ha convertido en el método de más rápido crecimiento para resolver la estructura de macromoléculas biológicas, y se espera que cryo-ET muestre cómo estas moléculas trabajan juntas en su contexto celular natural. Sin embargo, debido a limitaciones de relación señal-ruido, la mayoría de las proteínas humanas y animales son demasiado pequeñas para ser analizadas por estos métodos. Se espera que el aumento en la relación señal-ruido proporcionado por esta placa de fase láser supere estas limitaciones importantes".

Un láser extraordinario revela estructuras celulares ocultas

La innovación se basa en lo que los investigadores describen como el láser continuo de enfoque más intenso del mundo. En lugar de simplemente iluminar una muestra, el láser interactúa directamente con el haz de electrones del microscopio, alterando su fase para aumentar el contraste de la imagen.

Este ajuste facilita la distinción de pequeñas moléculas, como la hemoglobina, de su entorno, y podría mejorar la visibilidad de estructuras internas de las células, como el núcleo y las mitocondrias. Bridget Carragher, directora técnica de imágenes en Biohub, mencionó: "Con cryo-ET, estamos observando material celular muy complicado que está increíblemente abarrotado dentro de la célula. Es como un bosque de árboles, y estás tratando de encontrar una hoja en un árbol. Cryo-ET necesita un avance dramático en contraste para que podamos empezar a ver lo que está sucediendo dentro de la célula. Eso es lo que la placa de fase láser promete ofrecernos".

Con el apoyo financiero de Biohub, Müller adquirió un instrumento de cryo-EM avanzado y lo equipó con la nueva placa de fase láser, que fue nombrada "Theia", en honor a la titánide griega asociada con la luz y el resplandor. Por su parte, Carragher dirige la construcción de un microscopio relacionado en la instalación de imágenes de Biohub, que utiliza dos láseres en lugar de uno, basándose en investigaciones teóricas realizadas por Müller y sus colaboradores.

Ambos equipos de investigación están colaborando con Thermo Fisher Scientific, el principal fabricante de instrumentos de cryo-EM.

"Theia es el microscopio de Fórmula 1", afirmó Müller. "Tiene ópticas electrónicas adicionales que le otorgan una mejor resolución que el cryo-EM estándar, incluso sin el láser. Con la adición de la placa de fase láser, esperamos que se convierta en el mejor instrumento del mundo en general".

Los últimos hallazgos e imágenes técnicas del equipo de Berkeley fueron presentados en la revista Science. Los detalles sobre el diseño de dos láseres de Biohub están disponibles en un preprint recientemente publicado.

Cómo un descubrimiento galardonado con el Nobel cambió la microscopía

Para entender la importancia de esta nueva tecnología, es útil observar un desafío de larga data en la imagen biológica. Debido a que las células vegetales y animales están compuestas en gran parte de agua, son relativamente transparentes cuando se ven bajo un microscopio de luz ordinario. Aunque esta transparencia podría parecer beneficiosa, crea un problema. Las pequeñas estructuras celulares, como las mitocondrias y los núcleos, dispersan muy poca luz y, por lo tanto, aparecen solo ligeramente más oscuras que el material circundante.

Los científicos han abordado tradicionalmente este problema añadiendo tintes para crear un mayor contraste, pero el teñido también mata las células. En 1930, el físico holandés Frits Zernike se dio cuenta de que la luz que pasa a través de material biológico cambia de más formas que simplemente volverse más brillante o más tenue. Cuando la luz se dispersa dentro de una célula, también experimenta un pequeño retraso que cambia su fase, o el momento de sus picos de onda.

Aunque el ojo humano no puede detectar directamente este cambio de fase, Zernike descubrió que se podía convertir en una diferencia visible en el brillo. Al desplazar la fase de la luz no dispersada en 90 grados, logró que características celulares sutiles se destacaran más claramente contra su fondo cuando la luz llegaba a los ojos del espectador. Esta innovación se convirtió en la base de la microscopía de contraste de fase, lo que le valió a Zernike el Premio Nobel de Física de 1953.

Para la década de 1940, los científicos ya habían reconocido cuán útil era el contraste de fase para estudiar células. Comenzaron a explorar si la misma idea podría mejorar los microscopios electrónicos, que utilizan electrones en lugar de luz para examinar estructuras tan pequeñas como proteínas individuales.

Desafortunadamente, los primeros intentos encontraron serias dificultades técnicas. Los dispositivos diseñados para alterar la fase de los haces de electrones a menudo debilitaban demasiado el haz, introducían inestabilidad en la imagen o reducían la resolución.

Una posible solución surgió en 2010, cuando Müller y Robert Glaeser, ahora profesor emérito de biología molecular y celular en UC Berkeley, propusieron utilizar un láser intenso para producir el cambio de fase necesario. Su enfoque ofreció una manera de mejorar el contraste sin sacrificar la intensidad del haz de electrones.

Superando los límites de la microscopía electrónica

Glaeser ha desempeñado un papel importante en el desarrollo de cryo-EM, que ofrece una forma potencialmente más simple de determinar estructuras moleculares que la cristalografía de rayos X tradicional. La cristalografía de rayos X requiere que los investigadores cultiven cristales de las moléculas que desean estudiar y obtengan acceso a una fuente intensa de rayos X. Cryo-EM evita la necesidad de cristalizar las moléculas, pero presenta sus propias dificultades.

Uno de los mayores problemas es que un haz de electrones puede calentar y, eventualmente, dañar la muestra que se examina. Esto limita la cantidad de información que se puede recopilar y cuán detalladas pueden ser las imágenes resultantes. Cubrir las muestras con metal puede reducir el daño y mejorar el contraste, pero también hace que las imágenes sean menos nítidas.

Durante la década de 1960, los investigadores comenzaron a investigar si congelar muestras biológicas podría protegerlas del daño por radiación. Glaeser demostró que enfriar las muestras ayudaba a preservarlas durante la imagen. También propuso utilizar un haz de electrones menos intenso para examinar miles de moléculas congeladas a la vez, limitando aún más el daño.

Como las moléculas estarían posicionadas en diferentes ángulos, las computadoras podrían analizar y combinar sus imágenes para reconstruir una estructura molecular altamente detallada. Estos avances ayudaron a establecer las bases de la moderna cryo-EM, cuyos desarrolladores recibieron el Premio Nobel de Química de 2017. Durante sus discursos de aceptación, los laureados del Nobel reconocieron las contribuciones de Glaeser.

El Comité Nobel elogió la tecnología, explicando que cryo-EM "simplifica y mejora la imagen de biomoléculas. Este método ha llevado a la bioquímica a una nueva era".

Una búsqueda de 15 años para aprovechar un láser excepcionalmente potente

Convertir el concepto de la placa de fase láser en una tecnología funcional requirió años de ingeniería. Tras su propuesta en 2010, Müller pasó 15 años persiguiendo la idea, con parte de la investigación apoyada por los Institutos Nacionales de Salud.

El primer gran desafío fue generar un haz de láser extraordinariamente intenso concentrado en un área diminuta. Los investigadores necesitaban suficiente intensidad de luz para cambiar la fase de un haz de electrones en 90 grados.

Desarrollar el sistema necesario tomó una década. Su solución fue confinar un haz de láser continuo dentro de una cámara esférica revestida de espejos. A medida que la luz se reflejaba repetidamente a través de la cavidad más de 10,000 veces, su intensidad aumentaba drásticamente mientras el haz se enfocaba en un punto extremadamente pequeño.

"Es 75 kilovatios enfocados a unos pocos micrones", dijo Müller. "Eso es más poderoso que lo que se usa para soldar. Es más potencia que un láser militar. Construye el enfoque láser continuo más brillante jamás logrado".

El equipo demostró por primera vez que el concepto funcionaba al instalar una placa de fase láser en uno de los microscopios electrónicos más antiguos de Glaeser. Un financiamiento adicional de Biohub luego hizo posible adquirir un microscopio cryo-EM de última generación de Thermo Fisher y modificarlo para acomodar la tecnología láser.

En su última investigación, los científicos probaron el microscopio mejorado utilizando seis muestras diferentes que variaban en tamaño y método de preparación. El láser mejoró consistentemente la resolución de las imágenes, con ganancias particularmente importantes para muestras que son difíciles de visualizar utilizando métodos estándar.

"Para los casos más desafiantes — partículas pequeñas, muestras deficientes — el láser produce una ventaja considerable", afirmó Müller.

Imágenes más nítidas de proteínas que antes eran demasiado pequeñas para estudiar

Para demostrar las capacidades del nuevo microscopio, los investigadores reconstruyeron imágenes de dos proteínas diferentes. La primera fue la aldolasa, una proteína que se encuentra en el músculo y que los sistemas modernos de cryo-EM pueden ya visualizar relativamente fácil. La segunda fue la hemoglobina, la proteína responsable de transportar oxígeno a través del torrente sanguíneo.

La hemoglobina es mucho más pequeña y se encuentra cerca del límite inferior de tamaño de las proteínas que los instrumentos convencionales de cryo-EM pueden analizar de manera confiable. Utilizando la placa de fase láser, los investigadores mejoraron la resolución de ambas estructuras proteicas. La mejora fue especialmente pronunciada para la hemoglobina, destacando el potencial de la tecnología para superar las dificultades asociadas con moléculas más pequeñas.

"La conclusión es que, si tienes una proteína grande y una muestra realmente buena — una fresca o una congelada sin burbujas, por ejemplo — puede que no necesites la placa de fase para obtener una imagen única de alta calidad. Pero para una proteína pequeña y una muestra deficiente, el láser es lo mejor", afirmó Müller. "Esto podría llenar un enorme vacío en nuestro conocimiento de las estructuras proteicas que no pueden cristalizarse o son demasiado pequeñas para el cryo-EM actual. Y será revolucionario para el cryo-ET".

La masa de las proteínas se expresa típicamente en daltons, una unidad nombrada en honor al químico inglés John Dalton. Un dalton se define como una doceava parte de la masa de un átomo de carbono-12. El cryo-EM convencional tiene dificultades para visualizar proteínas más pequeñas que aproximadamente 70 kilodaltons. Esta limitación es particularmente significativa porque las proteínas por debajo de este umbral representan alrededor del 90% del proteoma humano, la colección completa de proteínas producidas por el cuerpo humano.

Con la placa de fase láser, los investigadores ahora pueden visualizar proteínas tan pequeñas como 50 kilodaltons, aunque hacerlo sigue siendo un desafío. Estas proteínas son incluso más pequeñas que la hemoglobina.

El próximo objetivo es revelar proteínas aún más pequeñas

Müller cree que la tecnología podría permitir a los científicos estudiar proteínas tan pequeñas como 17 kilodaltons (el tamaño de la proteína mioglobina). Alcanzar ese objetivo puede requerir otra mejora: utilizar un haz de electrones enfocado en lugar del haz difuso que actualmente se necesita para producir suficiente contraste sin la placa de fase láser.

Según Müller, el sistema láser debería permitir obtener contraste directamente de los cambios de fase en un haz de electrones enfocado. Si tiene éxito, este ajuste podría duplicar el contraste y la relación señal-ruido nuevamente, sumando a la mejora ya lograda con la placa de fase láser.

Tal progreso podría permitir estudiar una proporción mucho mayor de las proteínas del cuerpo y proporcionar una visión sin precedentes de cómo interactúan dentro del complejo entorno de las células. "Esta tecnología es un cambio de función para la biología", afirmó Stephani Otte, vicepresidenta de ciencia de imágenes de Biohub. "Vamos a poder ver cómo funcionan las máquinas moleculares dentro de la célula viva, en contexto, por primera vez. Lo que antes era invisible se volverá visible, y eso cambia todo sobre cómo entendemos la enfermedad".

El equipo de investigación de Berkeley también incluye a Glaeser; a los becarios postdoctorales y coautores principales Petar Petrov y Jessie Zhang; al científico del personal Jonathan Remis; al becario postdoctoral Hang Cheng; y a estudiantes de posgrado en física actuales y anteriores Jeremy Axelrod, Eric Cooper, Ian Hicklin, Shahar Sandhaus y Cooper Schnurr. En Biohub, Carragher y David Agard, el director científico fundador de imágenes de la organización, dirigen conjuntamente el grupo de Biología Celular Estructural Dinámica. Ambos son co-autores correspondientes del preprint de Biohub, junto con el ingeniero de Biohub Pavel Olshin.

Temas